La pasada temporada se dieron todas las condiciones necesarias para favorecer la incidencia de Botrytis cinerea (Botrytis) o pudrición gris, causando graves pérdidas en uva de mesa pero aun más graves en uva para vinificación. El primer factor fue una floración especialmente larga, lo que obligó a modificar el posicionamiento de las moléculas de control, en una primavera que además presentó lluvias, para luego rematar la temporada con lluvias récord en el mes de abril. Precipitaciones que alcanzaron a afectar una parte menor de la cosecha de uva de mesa pero que resultaron un desastre para una parte importante de la uva para vino. Los resultados que analizaremos con la fitopatóloga Marcela Esterio corresponden a  promedios obtenidos en predios donde se ha efectuado un seguimiento continuo de los niveles de sensibilidad a las moléculas fungicidas base de los programas de control (fungicidas frontales) en predios de la región Metropolitana, más algunos resultados importantes en predios de la región de O’Higgins. El que los datos sean promediales significa que puede haber campos que están bien o moderadamente bien, pero así mismo que puede haber campos que están en una condición más complicada. La metodología a seguir es la que tradicionalmente utiliza el laboratorio en la Plataforma de Sensibilidad a Botryticidas. “En cada predio se colectan muestras de al menos seis sectores en floración y precosecha, se procesan, se recuperan los aislados y se procede a realizar los análisis de sensibilidad según sea el modo de acción de cada molécula, estableciéndose distintas categorías según valores EC50, bajo y sobre los puntos de cortes establecidos para cada una de éstas”, explica Esterio. En el caso de las hydroxyanilidas (fenhexamid), moléculas clave en precosecha, según los trabajos de los últimos 5 años, hemos establecidos 5 categorías de sensibilidad, poblaciones de aislados con valores EC50 promedio inferiores a 0,17 µg/mL se consideran como altamente sensibles, con leve pérdida de sensibilidad cuando están en el rango entre 0,17 y 1,5 µg/mL, leve resistencia cuando se sitúan entre 1,5 y 4 µg/mL, moderada resistencia cuando están en el rango entre 4 y 9 µg/mL y, cuando están por sobre 9 µg/mL se los consideramos como altamente resistentes”, señala la experta.

SITUACIÓN PROMEDIAL DE SENSIBILIDAD A FENHEXAMID

Los resultados observados en la Figura 1 indican que en floración de la temporada 2014-15 poco más del 32% de los aislados era sensible a la molécula, en tanto que el 47,21% era altamente resistente. Si sumamos todas las categorías vemos que el conjunto se inclina más hacia la resistencia que hacia la sensibilidad. Durante la temporada se mantiene el porcentaje de aislados sensibles pero se incrementa el porcentaje de los aislados con leve pérdida de sensibilidad, por lo que el sistema se mueve hacia un mayor predominio de aislados más sensibles que resistentes. En la temporada pasada (2015-16), en tanto, partimos con un 74% de aislados sensibles y cero aislados de alta resistencia. Sin embargo, pese a que se mantiene el predominio de los sensibles, de 0 aislados altamente resistentes en floración a cosecha se sube a 42,86%. “Estos resultados nos muestran una tendencia pero no sabemos a qué realmente está asociado ese incremento de pérdida de sensibilidad y, por tanto, tampoco sabemos qué tan estable será en el tiempo y si será necesario realizar cambios drásticos en el programa o medidas de protección con otros fungicidas para recuperar la sensibilidad. El desarrollo de la nueva tecnología de sonda única aportará dicha información (ver artículo en Redagrícola 79).

SITUACIÓN PROMEDIAL DE SENSIBILIDAD A FLUDIOXONIL

Explica Esterio que los análisis siempre los hacen primero a Fludioxonil y luego a la mezcla cyprodinil & fludioxonil, ya que cyprodinil, por sí solo, no está en el mercado. La idea es observar cómo evoluciona la sensibilidad a Fludioxonil para luego ver cómo se comporta la mezcla fungicida. Herramienta, esta última, que actualmente es considerada clave en el control de Botrytis por la especialista.

En la Figura 2 el punto de corte para fludioxonil es de 0,7 µg/mL . Es decir, bajo ese punto los aislados son sensibles y sobre éste son resistentes. En este escenario resultó que solo el 0,15% de los aislados en floración presentaron valores EC50 superiores a dicho punto. Pero en la Figura 3,  en donde se consideró  como punto de corte 0,1µg/mL (valor crítico inicial que permite detectar incrementos de los valores EC50 para frenar el desarrollo de resistencia), los aislados que presentan valores inferiores a 0,1 µg/mL son sensibles y superiores a  3 altamente resistentes; en este caso se consideran rangos intermedios: levemente resistentes de 0,1 a 0,3µg/mL y moderadamente resistentes entre 0,3 a 3 µg/mL. “En primer lugar se observa que no hay población altamente resistente, luego que hay un predominio, en todas las etapas, de población altamente sensible, pero que al inicio de la floración 2014-15 había un 16,76% con leve pérdida de sensibilidad, con valores que se mueven entre 0,1 / 0,11 / 0,12 / 0,13 y 0,14 µg/mL. Lo importante es que en floración se detecta un 5,88% de aislados moderadamente resistentes pero a cosecha esta categoría de aislados desaparece, o sea son aislados poco estables”, afirma la investigadora. Estos aislados probablemente desaparecen por el alto costo metabólico que enfrenta el hongo al generar la resistencia. Lo que en la práctica le ha permitido a la mezcla de cyprodinil & fludioxonil mantener su eficacia. “Pero ojo porque están subiendo los valores EC50”, advierte Esterio, por lo que la especialista recomienda proteger la mezcla fungicida. Figura 3. Distribución porcentual de aislados de B. cinerea por categoría de sensibilidad a fludioxonil según EC50 promedio 5 predios/ Punto de corte 0,1µg/mL. Región Metropolitana.Temporadas 2014/15 y 2015/16.

SITUACIÓN PROMEDIAL DE SENSIBILIDAD A MEZCLA CYPRODINIL & FLUDIOXONIL

En la mezcla fungicida cyprodinil & fludioxonil, con punto de corte de 0,7 µg/mL, en los mismos aislados se observa algo semejante al caso anterior (fludioxonil solo). “Sin embargo, la situación cambia un poco cuando se corta en 0,1 µg/mL, ya que aumentan los aislados levemente resistentes, pero los aislados generalmente presentan valores EC50 son muy cercanos al punto de corte, fluctuando entre  0,1 / 0,12 / 0,13 / 0,14 µg/mL y el máximo alcanza solo 0,243 µg/mL, el valor más alto que hemos detectado a la mezcla fungicida”. En este caso, según Esterio, no se puede afirmar que haya pérdida de eficacia a nivel de campo porque la mayoría de los aislados se encuentran en los niveles o rangos de mayor sensibilidad según escala de categorización – valores críticos considerada.

“La gran pregunta que se están haciendo los productores es, ‘si la mezcla no tiene problemas de sensibilidad apliquémosla en inicio y en plena Flor’, pero cuidado”, advierte Esterio, pues considera que no es recomendable repetir aplicaciones de la mezcla cyprodinil & fludioxonil en este periodo, “en primer lugar porque existen varias otras moléculas que pueden aportar al control, pero además porque es fundamental mantener la eficacia de la mezcla y que su uso apoye para recuperar la sensibilidad de los otros fungicidas claves en los programas de control”, señala la profesional.

SITUACIÓN PROMEDIAL DE SENSIBILIDAD A BOSCALID EN RM

Según la especialista, el punto de corte para Boscalid ha ido cambiado bastante en el tiempo. Primero fue de 0,5 µg/mL, después de 2 µg/mL, y luego de 5 µg/mL. “A nivel internacional hoy se ha definido un valor cercano a 15 µg/mL como punto de corte o valor crítico para considerar a un aislado de B. cinerea como resistente. En nuestro laboratorio y en concordancia con otros autores, fijamos el punto de corte en 15 µg/mL “, señala la fitopatóloga.

En la Figura 6 se observa al inicio en floración de la primera temporada un predominio de aislados sensibles (68,29%) pero al término de la misma temporada, el porcentaje de aislados sensibles cae a solo un 20%. “Como estos resultados son promedios de los mismos huertos, en cierta forma se aprecia un efecto de los diferentes tipos de programas a los que estos fueron sometidos. Es así que en algunos predios hemos logrado recuperar la sensibilidad, por lo que no sería una resistencia estable, pero en otros predios se mantiene e incluso se incrementa”, afirma. “Un aspecto que es muy importante de considerar es que en un gran porcentaje de los predios analizados durante las últimas 4 temporadas, al determinar el nivel de sensibilidad a boscalid evaluando la germinación conidial, los valores EC50 pueden ser altos y en algunos casos muy altos, pero cuando posteriormente se mide la elongación del tubo germinativo sobre los mismos aislados, estos valores bajan bastante. Lo importante de este hecho es que en predios que generalmente han presentado una condición de alta resistencia a boscalid, cuya condición se mantiene incluso al no incluirse el fungicida en los programas de control, los EC50 siguen siendo altos. Cuando secuenciemos estos aislados y determinemos las mutaciones presentes en el nuevo proyecto FIA, vamos a poder respondernos muchas de estas preguntas”, dice Esterio.

SITUACIÓN PROMEDIAL DE SENSIBILIDAD A TEBUCONAZOLE (RM)

En la floración de la temporada 2014/15 los aislados sensibles a tebuconazole representaban cerca del 30% y a cosecha  bajan a solo 6%. Sin embargo, al año siguiente se parte con un 7% para terminar en cosecha con un valor cercano a 20%. Pero, en el caso de los aislados altamente resistentes (en rojo) se observa que la resistencia es muy fluctuante aunque tiende a mantenerse. “A nosotros la pérdida de sensibilidad a tebuconazole no nos asusta como tal, el problema es que la pérdida de sensibilidad a tebuconazole está gatillando pérdida de sensibilidad a otras moléculas mucho más importantes”, advierte la fitopatóloga.

SENSIBILIDAD A BOTRITICIDAS REGIÓN DE O´HIGGINS: MÁS PREOCUPANTE EN ALGUNOS DE LOS PREDIOS

En la región de O´Higgins el problema de pérdida de sensibilidad a las distintas moléculas fungicidas en algunos predios es mayor que en RM. Esto es consecuencia de la mayor presión de selección al que son sometidas las poblaciones del hongo porque las condiciones climáticas son mucho más favorables para el desarrollo de infecciones por Botrytis (mayor N° de aplicaciones fungicidas) y, también es el resultado del uso de programas de control que muchas veces no son los más adecuados. En esta región, si bien fludioxonil no presenta problemas cuando el punto de corte se fija a 0,7 ppm, a 0,1 ppm aparecen algunos aislados levemente resistentes. En tanto que la mezcla de cyprodinil y fludioxonil presenta un 100% de sensibilidad. Aun al considerar el punto de corte más bajo, de 0,1 µg/mL, se mantiene la tendencia detectada en la RM, con presencia de aislados con valores EC50 superiores a esa cifra pero muy cercanos al punto de corte. Por tanto, analizaremos más en detalle solo la situación de fenhexamid, boscalid y tebuconazole.

Los valores indicados en la Figura 8 señalan la situación de sensibilidad promedio a fenhexamid presentada en los 5 predios muestreados, lo que no significa que esa es la condición regional. Sin embargo, “es una alerta que nos indica que tenemos que mejorar los manejos y diseñar programas óptimos de control para evitar llegar a condiciones tan extremas”, señala la especialista.

La situación de boscalid, sin embargo, pareciera ser más complicada en O’Higgins que en RM. “De un 71,62% de aislados sensibles se pasa a 45,61% (floración y cosecha, temporada 2014-15 respectivamente) y luego en la última temporada (2015-16), de 33,43% de aislados sensibles en floración se llega a cosecha a solo 3,43% de aislados sensibles (95,33% de aislados altamente resistentes)”. Esterio explica que en este caso en particular “es posible que el incremento de resistencia esté asociada a mutaciones fuertes o estables”. En todo caso, enfatiza, “la situación real debe ser analizada predio a predio ya que la información promedial solo indica que en algunos predios la resistencia se ha ido incrementando”. Sin embargo, estos resultados son una alerta ya que así como pueden haber predios con mucha resistencia a esta molécula, otros muchos predios pueden presentar un nivel de sensibilidad aceptable. Por otro lado, “si analizamos en los mismos aislados la elongación del tubo germinativo puede que nos encontremos con interesantes sorpresas y que un porcentaje importante de los aislados presente altos valores EC50 para germinación conidial, pero pueden presentar deficiencias en la elongación del tubo germinativo y por lo que con menor concentración se puede inhibir el crecimiento del hongo”.

Está claro que el desarrollo de resistencia a boscalid es un problema, y realmente puede llegar a ser dramático si no se toman las medidas pertinentes. “Estamos estudiando y determinaremos qué tipo de aislados presentan las mutaciones complicadas y en base a ello podremos sugerir cambios en los programas de control que permitan recuperar la sensibilidad a ésta molécula”, afirma la investigadora.

En el caso de tebuconazole en O’Higgins, también  se ha detectado un incremento de los aislados resistentes pero particularmente de los altamente resistentes.

QUÉ NOS DICE EL ANÁLISIS DE LOS RESULTADOS

Según Esterio, el incremento de pérdida de sensibilidad a fenhexamid, que se constata en algunos de los predios prospectados, podría estar comprometiendo la eficacia a nivel de campo de ese fungicida y de otras moléculas de similar modo de acción. Por ejemplo, fenpyrazamine (Kamuy®) y por supuesto también de los genéricos asociados al mismo grupo. “Para la industria es muy importante recuperar la sensibilidad a fenhexamid porque es la molécula clave en precosecha. No hay otra”, asevera la investigadora. Y aunque efectivamente haya resistencia, “de flor a envero se debe diseñar un programa que apunte a controlar todos los aislados resistentes a fenhexamid de modo de mantener a esta molécula posicionada en precosecha y así mismo mantener como una alternativa eficiente a fenpyrazamine para una de las aplicaciones de Flor”.

¿CÓMO RECUPERAR LA SENSIBILIDAD A FENHEXAMID?

Para recuperar la sensibilidad a fenhexamid es necesario conocer el tipo de mutación asociada y su frecuencia en las poblaciones de aislados resistentes  recuperados. Información que pronto estará disponible gracias a la nueva etapa del proyecto FIA. “En base a esa información podremos sugerir cambios en los  programas de control evaluando el efecto de distintas moléculas alternativas no residuales previo al uso de fenhexamid. Por ejemplo, antagonistas biológicos tales como Bacillus subtilis (Serenade), Bacillus amiloliquefaciens (Serifel), aplicados previo a flor  y entre aplicaciones de fungicidas frontales de inicio y plena flor, como también en envero y previo a aplicaciones de fenhexamid en precosecha.

Por otro lado formulaciones eficientes de trichodermas, como Trichonativa®, aplicadas en épocas tempranas previo a inicio de flor (7 – 10 días) e inmediatamente en post-flor, también podrían ayudarnos a bajar la frecuencia de los aislados resistentes. “La temporada recién pasada evaluamos el efecto de estas aplicaciones y aunque fue un ensayo muy pequeño, señala la especialista,  los resultados fueron muy interesantes y se logró bajar el nivel de infección respecto de un tratamiento testigo con solo aplicaciones de fungicidas tradicionales frontales en el periodo de flor (Figura 11)”.

Son alternativas interesantes de incorporar de manera intercalada aplicaciones de productos orgánicos no residuales tales como extractos de plantas (extractos cítricos, de la planta del Té, Melaleuca alternifolia, u otros). Por ejemplo, en el caso de aplicaciones de M. alternifolia, Timorex Gold®, se logra un interesante efecto secante sobre Botrytis. En Colombia, en la sabana de Bogotá, en flores de corte, cultivos que son aún más susceptibles que la uva de mesa a Botrytis, y en donde la presión de selección por fungicidas es muy superior a nuestra realidad, la incorporación de aplicaciones de este producto de manera intercalada ha logrado interesantes resultados, obteniéndose valores de eficacia superiores a los tratamientos tradicionales pero similares estadísticamente, con una menor carga residual. También está el caso de Kaligreen® (hidrogenocarbonato de K), que podría tener un efecto muy similar a los extractos de plantas, y que es otra interesante herramienta a considerar para cambiar los mapas de sensibilidad de las poblaciones.

Por otra parte, en un futuro no muy lejano, existirá la posibilidad de aplicar -previo al uso de fenhexamid- algunas nuevas moléculas fungicidas próximas a registrarse. Por ejemplo, nuevas moléculas pertenecientes al grupo de las carboxamidas. Sin embargo, Esterio insiste en la importancia de incorporar en la rotación las moléculas fungicidas alternativas no residuales. “Yo creo que es el soporte que nos permitirá recupera la sensibilidad tanto a fenhexamid como a las carboxamidas, y lo que es muy importante, de manera medioambientalmente más sustentable”, señala.

POR QUÉ ES IMPORTANTE MANEJAR LA RESISTENCIA A BOSCALID

El incremento de la pérdida de sensibilidad a boscalid, que en algunos predios hoy ya podría afectar la eficacia a nivel de campo de este fungicida, a futuro podría también afectar a las moléculas homólogas próximas a registrarse en el mercado nacional (fluopyram, isofetamida, adepdyn,…). “Todas las nuevas moléculas fungicidas próximas a estrenarse son carboxamidas, tal como boscalid”, advierte Esterio. “Algunas de éstas controlan a algunos de los aislados resistentes a boscalid, pero no tienen efecto sobre otros y además, según los antecedentes existentes, un mal uso de las nuevas moléculas podría generar resistencia cruzada positiva entre varias de éstas”, puntualiza.

Por otro lado, en las últimas temporadas han podido constatar en algunos predios que cuando hay resistencia a fenhexamid, la mayor parte de las veces esos mismos aislados son más sensibles a carboxamidas y por otro lado, cuando hay más resistencia a carboxamidas, esos aislados son más sensibles a fenhexamid. Explica la investigadora que esperan clarificar más esta situación en base a nuevos estudios.  Es interesante el caso de fluopyram, nueva carboxamida aún sin registro para Botrytis en Chile. “Al analizar el comportamiento de un número representativo de aislados a fluopyram, los que no habían sido sometidos previamente a esta molécula pero que correspondían -según análisis previos- a aislados altamente sensibles a boscalid (EC50< 2 – 5 µg/mL), los resultados señalan una gran efectividad. Cerca del 94% de la población presentaba valores EC50 entre 0,01 y 1 µg/mL en germinación conidial y al igual que boscalid tiene aún un mayor efecto sobre la elongación del tubo germinativo (0,001 – 0,1 µg/mL)”, explica la investigadora (Figura 12). O el caso de isofetamida, en que los resultados obtenidos en un bajo número de aislados nacionales analizados, el 90% de éstos han presentado valores entre 0,01 y 0,1µg/mL, pero estos resultados no pueden considerarse como definitivos, ya que es necesario analizar un mayor número de aislados.

“Estas mediciones iniciales, que corresponeden a lo que se denomina como Línea Base de Sensibilidad a Fungicidas, son importantes porque nos permitirán ver y comparar cómo va cambiando la población a medida de que se incorporan las nuevas moléculas fungicidas y mediante monitoreos poder detectar tempranamente los cambios en los niveles de sensibilidad”, anticipa Esterio.

El primer reporte de resistencia a Boscalid en Chile se hizo el año 2011 (Esterio et al). En el Esquema 1 las barras verdes corresponden a mutaciones que están presentes en zonas NO conservadas del genoma del hongo por lo que mediante cambios sencillos en el manejo y posicionando bien la molécula, debería ser factible recuperar la sensibilidad. En cambio las barras rojas corresponden a las mutaciones ‘pesadas’, presentes en zonas conservadas del genoma y que por tanto son más difícil de mover. “La mutación G37S, por su parte, corresponde a una mutación nueva no descrita antes en Botrytis, la que fue detectada en aislados resistentes recuperados desde arándano en estudio de tesis realizado en nuestro laboratorio”, explica la experta.

En fluopyram, “si analizamos los aislados que presentan esas mutaciones, resulta que esta nueva molécula va a ser un excelente apoyo a boscalid porque va a controlar todas las mutaciones que están en zonas no conservadas (barras verdes). Sin embargo, no va a lograr ningún control de las mutaciones que están en las zonas conservadas (barras rojas). Más aún, si se insiste en la aplicación de fluopyram, este tipo de mutaciones irán aumentando con el riesgo de que se genere una sostenida pérdida de sensibilidad a varias moléculas de este grupo de fungicidas”, señala Esterio. Lo mismo podría ocurrir con isofetamida, y quizás también con otras moléculas de este grupo pero sobre esto aun no se dispone de suficiente información.

-¿Cómo recuperar la sensibilidad a Boscalid y así proteger a las nuevas carboximidas?

La recomendación de la especialista es posicionar a esta molécula en la época adecuada, protegiéndola con fungicidas químicos y alternativos no residuales, de la misma forma en que ya se ha indicado para el caso de la recuperación de sensibilidad a hydroxyanilidas (fenhexamid). Pero, insiste, “para hacerlo correctamente se debe conocer la causa de la pérdida de sensibilidad, los tipos de mutaciones y la frecuencia de éstas, para lo que se requiere de análisis moleculares -extracción de ADN, secuenciación, alineamientos,…-, técnicas que son de alto costo. Sin embargo, ese costo se verá reducido gracias al proyecto de sonda única lanzado este año”.

PÉRDIDA DE SENSIBILIDAD A TEBUCONAZOLE

En algunos casos, según la investigadora, la pérdida de sensibilidad a tebuconazole ya puede ser considerada como resistencia. El problema de esta molécula es que su uso ha sido repetitivo o, en otros casos, se ha utilizado como acompañante de terceras moléculas, y “por lo general la molécula a la que acompaña no es de las más interesantes o más efectivas contra Botrytis”. En el caso de tebuconazole la pérdida de sensibilidad estaría causada tanto por mutaciones, algunas asociadas a alta resistencia; como por la eliminación de ciertos codones (triplete de nucleótidos); o a la sobre expresión de un gen.

El problema es que la pérdida de sensibilidad por sobre expresión de dicho gen es provocada por un aumento de la actividad de las proteínas de la membrana celular del hongo, lo que incrementa su capacidad general para detoxificar (eliminar tóxicos), provocando una menor sensibilidad general y por esa vía, la disminución de la eficacia de otras moléculas. Presupone Esterio que este mecanismo podría ser la causa de la rápida pérdida de sensibilidad a boscalid, por ejemplo, y de que la sensibilidad a fenhexamid haya disminuido fuertemente en algunos casos; incluso en circunstancias en que en los predios no se ha hecho un mal uso de esos fungicidas.