Por Dra. Claudia Bonomelli, Directora Departamento de Fruticultura y Enología. Pontificia Universidad Católica de Chile.

ANÁLISIS DE TEJIDO VEGETAL

El análisis fitoquímico o análisis del tejido vegetal, se refiere habitualmente, al análisis químico de hojas (foliar), pero es una analítica aplicable a cualquier tejido de la planta (ramillas, flores, frutos, otros). En el caso de las hojas, esta técnica de diagnóstico es ampliamente reconocida para determinar las concentraciones de nutrientes y con ello evaluar el estado nutricional de la especie vegetal. Es también una herramienta complementaria al análisis de suelo y a la sintomatología visual, lo que ayuda a la interpretación, con el fin de tomar decisiones acerca del manejo agronómico del huerto o viñedo. En el caso del análisis de hojas o tejido vegetal, se utiliza la planta como extractante de los nutrientes disponibles en el suelo y se mide el contenido total de éstos en los tejidos, a diferencia del caso del suelo que utiliza métodos de análisis que buscan simular la absorción de las raíces y, por lo tanto, determina los contenidos de elementos disponibles y de intercambio.

Figura 1.  A y B: Arena cristalina de oxalatos de calcio en microscopio de barrido, en hojas de vid de mesa; C y D) Oxalatos de calcio dentro de un idioblasto (i), en vid; Microscopia de barrido y Técnica de Fluorescencia, respectivamente.

El análisis foliar o de un tejido vegetal, utilizado como herramienta de diagnóstico, se fundamenta en que existe una relación característica y conocida de la concentración de nutrientes en la hoja, con los factores que afectan el desarrollo, crecimiento y/o rendimiento de una planta, siempre que ésta se encuentre en condiciones óptimas. Para establecer esas relaciones se han hecho muchos estudios científicos de larga duración, en distintos centros de investigación y universidades del mundo, generando lo que conocemos como estándares.

Estos estándares son el resultado de investigaciones en la que han participado fisiólogos vegetales, especialistas en nutrición vegetal, en química de suelos y estadísticos, entre otros, desarrollando funciones matemáticas que relacionan la concentración de nutrientes en plantas cultivadas y su potencial productivo, bajo condiciones experimentales controladas. Esto significa que para cada especie y nutriente se construyó, a través de la experimentación, la curva de respuesta del rendimiento desde una condición de baja concentración del nutriente a una situación de exceso.

El objetivo es poder predecir los comportamientos biológicos utilizando indicadores, como la concentración de nutrientes en las hojas, para emplearlo de forma rutinaria y práctica, y de este modo mantener el estado nutricional de las plantas en óptimas condiciones.

CONCENTRACIÓN DE NUTRIENTES – VARIABLE PREDICTIVA

Los estándares están construidos para un tipo de material vegetal específico de una edad fisiológica determinada (época de muestreo), por lo que es importante considerar que si bien el tejido vegetal a analizar puede ser cualquier parte de la planta, como hojas, pecíolos, raíces, frutos y otras, para el control de la nutrición se debe utilizar el tejido específico para el cual existe un estándar.

Lo anterior es fundamental dado que el nivel nutricional de los tejidos varía a lo largo de la temporada. Existen nutrientes que disminuyen con la edad del tejido y otros, que por el contrario, se van acumulando. Por esta razón el estándar es para cada nutriente y especie. Este aspecto es importante dado que la acumulación, translocación y dilución de los nutrientes, durante el ciclo de desarrollo de los vegetales, determina variaciones en las concentraciones de éstos. Las consideraciones que se han tenido presentes para definir las épocas de muestreo de las plantas, por una parte, se refieren al momento en que la mayoría de los elementos se presentan estables y, por otra, que el tejido elegido presente una mayor sensibilidad a los cambios en el suministro de nutrientes. En la mayoría de las especies esta época corresponde a una hoja recientemente madura.

Sin embargo, es importante mencionar que los estándares que existen de contenido de nutrientes en las hojas son buenos predictores del estado nutricional de la planta y no necesariamente de la calidad de postcosecha de los frutos. Por este motivo se han iniciado investigaciones que pretenden desarrollar nuevos indicadores que permitan predecir en mejor medida la calidad del fruto, utilizando otros tejidos vegetales.

TEJIDOS VEGETALES COMO INDICADORES DE LA NUTRICIÓN – FRUTOS

Como se ha señalado la concentración de nutrientes varía en la planta dependiendo del tejido, de la época en que se recolecte, de la edad del tejido, del vigor de la planta, entre otros factores. Por este motivo no se puede utilizar el estándar desarrollado con hojas para comparar con el nivel de ese nutriente en los frutos. En este caso se debe tener en cuenta que además existe una variación normal tanto entre frutos, dependiendo de su tamaño, posición en la rama, exposición a la luz, como dentro del mismo. Por ejemplo, no será la misma concentración de nutrientes cerca de la piel o epidermis del fruto, que la de cerca de la semilla, lo que implica estudiar y especificar a través de la investigación, la edad del tejido, su posición en la rama y la zona del fruto a analizar.

Por otra parte el desarrollo de nuevos indicadores requiere además del estudio acabado –en laboratorio– de diferentes metodologías para identificar y validar científicamente la metodología que entregue un indicador eficiente y eficaz. Es decir, que se correlacione bien con lo que buscamos predecir y que entregue un valor coherente.

NUTRICIÓN Y PATRÓN DE COMPORTAMIENTO DEL CALCIO EN LA PLANTA

El calcio es un macronutriente esencial para las plantas y de abundancia natural en el ambiente. Presenta una función extracelular como componente de la pared celular y la lamela media y una función intracelular, como elemento señal responsable de dar respuesta a cambios ambientales a través de cambios en la concentración de Ca2+, asociado a la proteína Calmodulina.

A nivel estructural el calcio es un elemento capaz de interactuar con las membranas celulares logrando la estabilización de éstas. Los grupos carboxílicos de las pectinas presentes en la pared celular se unen al Ca2+ para formar pectatos de calcio, los que actúan como cementantes con la posibilidad de formar uniones intermoleculares reversibles.

Por otra parte, dada la condición del calcio como elemento mensajero, se le ha denominado “ión de mayor y estricta regulación en organismos dependientes de membranas”. Esta regulación se realiza a través de su concentración espacio – temporal, por lo que este nutriente se encuentra en distintos compartimientos celulares, distribuyéndose de manera no uniforme en los tejidos vegetales, siendo la pared celular y la vacuola sus mayores sumideros.

CONTROL DEL CALCIO CITOSÓLICO

Por lo previamente descrito, en el citoplasma de las células vegetales se mantiene regulado el calcio a una baja concentración, en el rango micromolar. Frente al hecho de que en los suelos de Chile, en general, el calcio es abundante respecto a las necesidades de las plantas y que la absorción por las raíces no presenta restricciones, existen diversos mecanismos para poder mantener la concentración en el rango requerido.

A diferencia de moléculas más complejas, el calcio no puede ser químicamente alterado, por lo que para ejercer un control sobre él las células deben quelatar, secuestrar o expulsar este elemento. Uno de los procesos empleados es el de biomineralización que implica una precipitación físico-química del calcio y del acido oxálico, generando cristales de oxalato de calcio. Este mecanismo de precipitación del calcio dentro de vacuolas y cloroplastos logra reducir las concentraciones activas de este elemento, utilizando células especializadas en la compartamentalización del calcio, denominadas idioblastos (figura 1).

Estos cristales de oxalato de calcio son un mineral insoluble, lo que permite que pueda ser secuestrado de manera metabólicamente inactiva (figura 2). En algunos casos cerca del 90 % del calcio total de la planta puede encontrarse secuestrado de esta forma.

MECANISMOS DE MOVILIZACION DEL CALCIO

La planta absorbe el calcio como Ca2+ y generalmente no existen restricciones para su absorción. Se distribuye por xilema especialmente en zonas de la raíz donde la Banda de Caspari está discontinua o interrumpida. Por lo tanto al haber suministro de calcio en la solución del suelo no habría problemas a su entrada siempre que exista crecimiento.

Por otra parte, la forma de calcio que se transloca lo hace a través del xilema, ya sea como forma iónica o acomplejado con ácido málico o cítrico, principalmente hacia los tejidos con transpiración activa. Por lo tanto, órganos con mayor demanda evapotranspirativa, como hojas de brotes vigorosos, serían sumideros más fuertes para la acumulación de calcio y competirían con aquellos más débiles, como el fruto. El movimiento del calcio también se explica por otros factores, como la presencia de auxinas, las que aumentarían la actividad metabólica del tejido vegetal y con ello su concentración de calcio. Por otra parte, existe un sinergismo entre la movilidad del Ca y otros iones, como el boro, en la planta.

El suministro de nutrientes disponibles del suelo y la absorción radicular o foliar por parte de la planta determina la composición mineral de los tejidos vegetales, influyendo esto en la fruta, tanto en su firmeza y apariencia, como en su calidad general. Entre los nutrientes, el calcio es uno de los que más se ha relacionado con una mejor capacidad de almacenaje de la fruta y en general una mejor vida de poscosecha. A su vez la relación de este nutriente en los tejidos con otros elementos esenciales, como nitrógeno, potasio, magnesio, boro, entre otros, también puede influir en la calidad de la fruta.

Algunos desordenes fisiológicos en frutos aparecen relacionados con bajos niveles de calcio, producto de insuficiente suministro de este elemento hacia algunos tejidos, por ser éstos sumideros débiles. Esto se produciría debido a que el calcio no puede ser movilizado y redistribuido vía floema teniendo que ser suplido vía xilema, cuyo flujo estaría controlado principalmente por la transpiración. Así, el fruto sería un sumidero más débil, donde habitualmente se producen los desordenes asociados a las bajas concentraciones de calcio, lo que estaría más relacionado a una ineficiente distribución del calcio en la planta, que a una baja absorción de este elemento.

APLICACIONES PARA MEJORAR LA NUTRICIÓN DEL CALCIO

Existen muchos estudios en fruticultura sobre el efecto en la calidad de los frutos, de las aplicaciones de calcio de precosecha. Algunos estudios muestran que estas aplicaciones reducen desordenes fisiológicos, otros han señalado que estas aplicaciones no han tenido efecto en la firmeza del fruto, rendimiento, color, acidez titulable, pero sí en aumentar la concentración de calcio, disminuir la relación K/Ca o haber balanceado algunos índices en la fruta, como son el N/Ca y el (K+Mg)/Ca. Otros que no tienen ningún efecto significativo e incluso en algunos casos se reportan efectos negativos sobre la calidad de la fruta, habiéndose también observado daños en precosecha y poscosecha. En otros estudios se ha señalado que las aplicaciones foliares de nutrientes han presentado resultados no reproducibles, porque son distintas las condiciones de humedad y otros factores ambientales que intervienen en la absorción de los nutrientes. En definitiva, por esta diversidad de resultados, no existe consenso sobre la utilidad de las aplicaciones de calcio vía foliar.

Al analizar estos resultados se deben considerar distintos aspectos, en primer lugar, si ocurre o no la absorción del calcio por la fruta al realizar aplicaciones exógenas, pudiendo producirse retención en la cutícula y epidermis, ya que la penetración dependerá de la permeabilidad del tejido, que a su vez está influenciado por la especie frutal, características de su epidermis, presencia y composición de la cutícula, la cual varía a lo largo de la temporada de crecimiento. El segundo aspecto a considerar es que si el elemento ha entrado al tejido vegetal, que éste se pueda mover dentro de la planta y pueda llegar a las zonas donde se requiere.

MÉTODOS DE DIAGNÓSTICO DEL CALCIO EN LAS PLANTA

El calcio en los tejidos vegetales puede tener diferentes solubilidades, lo que influye en su actividad fisiológica.

El calcio puede estar ligado a ácidos orgánicos, neutralizando su efecto acidificante, o como calcio intercambiable adsorbido a grupos carboxilos de las pectinas o adsorbido a proteínas. Existe también el calcio fisiológicamente inactivo, precipitado como
oxalato.

De esta forma se puede entender que si la planta absorbe el calcio de las aplicaciones, ya sea desde el suelo o a través de las hojas o frutos, puede no estar en forma fisiológicamente activa, pudiendo una fracción precipitar, quedando insoluble, con poca o ninguna retranslocación hacia distintas partes de la planta o el fruto. De hecho el calcio no se encuentra uniformemente distribuido dentro de la célula siendo la pared celular y las vacuolas grandes sumideros.

La complejidad de la dinámica del calcio dentro de la planta, la variabilidad en los resultados obtenidos respecto de las aplicaciones exógenas y los métodos utilizados para determinar el contenido de calcio en los tejidos, hace difícil el diagnóstico de las deficiencias que puedan causar desórdenes fisiológicos. El método que se utiliza actualmente para controlar la nutrición del calcio en forma rutinaria, es la determinación de calcio total en hojas, lo que normalmente excede a la concentración de calcio libre en el fruto.

FORMAS DE CALCIO Y DETERMINACIÓN EN LABORATORIO

Actualmente algunos investigadores estudian una apropiada predicción de la nutrición con calcio en plantas frutales. Dentro de los métodos descritos más recientemente para la determinación de las diferentes formas de calcio se encuentran calcio soluble, calcio estructural y oxalatos de calcio. Sin embargo, para una misma determinación, existe gran variabilidad de métodos. Incluso para la determinación de calcio total en frutos existen varios métodos que aún no se han estandarizado. Por otra parte, no se han desarrollado estándares científicamente validados, que permitan utilizar estos indicadores en forma práctica.

Aún no se puede decir con certeza cuáles formas químicas se están midiendo realmente, cuando se mide el calcio ligado, ya que no hay estudios que hayan evaluado si éste corresponde al calcio estructural ligado a pectinas o por ejemplo a aquel que se encuentra ligado a ácidos orgánicos. Tampoco se ha evaluado qué precisión tendría la analítica y qué significan los números que arroja el análisis. Por ejemplo, valores en fruto de 10 mg Ca ligado/kg, ¿qué significa? Son altos, bajos, ¿para qué especie?, ¿en relación a qué? Todavía estos análisis requieren de mucha investigación y evaluación. Lo que es más importante, no existe la relación o función que describa el comportamiento biológico (capacidad de almacenaje, elasticidad de la pared celular, etc.) y los números que genera esta analítica.

Algunos investigadores lo están evaluando y utilizando para generar datos de investigación, pero esto no significa que esta analítica esté rutinizada y/o normada. Cuando se trabaja en Investigación se debe tener muy presente que un indicador, antes de rutinizarlo debe haber sido validado por la comunidad científica y esto, normalmente, se hace a través de publicaciones en revistas de nivel Internacional, que cuentan con comité de editores científicos.

Validar nuevas analíticas, generar estándares o indicadores es posible con el respaldo de proyectos de investigación en instituciones como las universidades con especialistas en distintas áreas, los cuales en una primera instancia estudian la fisiología y la dinámica de un nutriente en la planta y una vez que se construye el patrón de comportamiento a través de la experimentación, viene una segunda etapa que es la de rutinizar el método para generar el indicador. Por último debe validarse en diferentes condiciones.

En este sentido los profesores de la Facultad de Agronomía e Ingeniería Forestal de la Pontificia Universidad Católica de Chile, se encuentran trabajando en sus laboratorios de investigación y servicios, en el desarrollo de indicadores que tengan una fundamentación teórica analítica para que puedan ser validados internacionalmente y utilizados en forma práctica por nuestra agroindustria.