Los floricultores de Colombia —el segundo exportador de flores a nivel mundial, con importante presencia en países como EEUU, Japón, Reino Unido y Canadá— saben bien que el manejo de Botrytis cinerea, causante de la Pudrición gris, es una gran limitante. Esta es una industria competitiva que busca garantizar la calidad y durabilidad de las flores en los mercados de destino para afianzar los lazos con importadores y retailers y evitar graves pérdidas económicas. “Para las flores el problema más importante es sin duda botrytis”, manifiesta Marcela Esterio, fitopatóloga y profesora asociada de la Facultad de Ciencias Agronómicas de la Universidad de Chile, con más de 30 años investigando sobre la enfermedad.

Propone un enfoque de manejo integral que considere evitar el desarrollo de resistencia en las poblaciones del hongo a los diferentes modos de acción de los productos fungicidas, donde la incorporación de productos alternativos no residuales en los programas de control, puede hacer una gran diferencia. En esa línea, la experta internacional considera que es clave que los productores colombianos monitoreen la sensibilidad a las distintas moléculas fungicidas -de las poblaciones predominantes de botrytis- en los cultivos. Además, en el medio plazo, afirma que el sector floricultor debe migrar hacia análisis moleculares de resistencia, de modo de agilizar los tiempos de respuesta. Actualmente, mediante técnicas tradicionales de monitoreo de sensibilidad, los resultados pueden tardar hasta cuatro semanas, lo que resta eficacia a la hora de seleccionar las mejores herramientas de control de la enfermedad.

– ¿Cuáles son las principales especies de flores a las que afecta botrytis?

– Diría que afecta a todas las flores. El problema del cultivo de flores es que todos los periodos son críticos porque el tejido siempre está expuesto. A diferencia de cultivos como la uva de mesa, donde los periodos críticos son flor -de inicio a término- y desde envero a cosecha. En rosas, en tanto, es una enfermedad aún más crítica.

– ¿Qué nivel de conciencia tienen los productores de flores sobre la resistencia?

– Están muy preocupados, pero a nivel inicial. Conocen cuál es el problema. Pueden determinar que está incrementándose el nivel de pérdida de sensibilidad en tantas partes por millón (ppm), pero no necesariamente determinar cuál es la relación con las poblaciones presentes, cuáles son las mutaciones asociadas a esta pérdida de sensibilidad, como tampoco su frecuencia en las poblaciones de botrytis a nivel local. Diría que es algo que recién están considerando. Muestra de ello es que la primera tesis que se hizo en flores, por Tatiana Goméz en 2013, en donde se analizó molecularmente poblaciones de aislados del hongo recuperados desde distintas fincas de flores y desde distintos tipos de tejidos y paralelamente se determinó la sensibilidad a ciertas moléculas fungicidas. Este fue el primer estudio que se hizo.

– ¿Coincide que las condiciones óptimas para botrytis son las condiciones óptimas del cultivo de rosas, por ejemplo?

– El óptimo del cultivo siempre va a estar asociado a una condición óptima para botrytis. Botrytis no requiere de agua libre, le basta con alta humedad relativa. A través del control de clima se podría intentar disminuir el problema, pero no eliminarlo. Se intenta ventilar y mejorar la aireación, se busca evitar la condensación, mejorar la cobertura de los sistemas de aplicación, se intenta hacer deshojes, etc. Hay una tesis doctoral que se hizo hace no mucho en EE UU, en la que se determinó que, de lunes a viernes, cuando generalmente se concentra la mayor cantidad de labores dentro de las naves, se observa mucha mayor dispersión de inóculo en comparación a los fines de semana, cuando las tareas son mínimas. O sea, mover aire contamina. Si vas a mover aire previamente debiste haber efectuado alguna  aplicación para que el aire no disperse botrytis, como tampoco otro tipo de propágulos, por ejemplo conidias de oídio, o esporas de mildiú velloso, u otros patógenos fungosos que afectan a las flores.

– ¿En qué zonas de los invernaderos persiste el inóculo?

– El inóculo está en el ambiente, en los tocones que quedan al cortar las flores, en la cosecha. Por ejemplo, cuando se corta y queda un tejido vivo, este es colonizado rápidamente por las esporas. También va a estar, aunque en menor cantidad, en la hojarasca. Además, va a estar en las hojas, principalmente las que se ubican en el tercio medio superior. Botrytis no solo afecta a las flores, sino también a las hojas. Disminuir el inóculo es fundamental. En platabanda y en el piso de las naves se recomienda eliminar la hojarasca potencialmente contaminada.

LA RESISTENCIA COMO ANÁLISIS PREVIO AL CONTROL QUÍMICO

– ¿A qué se debe la resistencia a productos químicos de control que experimentan algunos productores de Colombia?

– El problema en Colombia es la alta frecuencia con que tienen que realizar aplicaciones de control con fungicidas. Entonces, ante esa presión de selección, es muy fácil desarrollar problemas de resistencia. La industria de los agroquímicos está muy preocupada de mantener la vida útil de estas moléculas. Por ejemplo, existen compañías comercializadoras de soluciones para el agro que ofrecen un programa de monitoreo de sensibilidad denominado Sensibility Flores. Un servicio que consiste en realizar monitoreos en base a muestreos y analítica, para conocer el nivel de sensibilidad de las poblaciones.  Pero los grupos privados muchas veces no les abren las puertas a las empresas de agroquímicos. Son muy selectivos. A las empresas les cuesta llegar.

– ¿Están en condiciones de salirse de las técnicas tradicionales de determinación de niveles de sensibilidad a fungicidas mediante crecimiento miceliar?

– Tienen mucho interés, pero realmente es un costo altísimo. En este momento apoyo a algunos de estos grupos, los que ya está introduciendo una aproximación molecular, pero a nivel básico. Les advertí que ya no podían quedarse en la placa de Petri, que tenían ir más allá y determinar el tipo y frecuencia de las mutaciones asociadas a resistencia a ciertas moléculas fungicidas consideradas como la base de los programas de control en las poblaciones predominantes, o sea, definir cuáles son esas mutaciones que están asociadas a esa resistencia y en qué frecuencia se encuentran. En la uva de mesa de exportación de Chile algunos productores nos cuestionan ¿cómo dices que hay resistencia a carboxamidas si hemos llegado bien a destino? Pero, lo que pasa es que el nivel de agresividad de los aislados depende del tipo de mutación predominante. El problema de botrytis tiene que ver con cómo partimos la temporada, si hemos introducido o no moléculas alternativas no residuales, como los productos en base a extractos de plantas como Melaleuca alternifolia, extracto de Quillaja saponaria, el extracto de Swinglea glutinosa y los extractos de cítricos, entre otros.  Así como también el uso de algunas formulaciones de Bacillus subtilis, como antagonistas biológicos. La idea es que no se usen solo fungicidas químicos.

– ¿Cómo se desarrolla y por qué varían los niveles de resistencia?

– Conforme al programa que se ha llevado durante las distintas campañas, se van seleccionando cepas resistentes con distintas mutaciones (aislados menos sensibles). Bajo ciertas condiciones se pueden generar mutaciones que son mucho más complicadas, que van a ser difícil de eliminar. En otros casos, se van a generar mutaciones no tan complicadas, ya que el costo metabólico para la población del hongo va a ser tan alto que esas poblaciones van a desaparecer con el tiempo. Eso pasa, por ejemplo, con Fenhexamid, un fungicida clave porque es el único botryticida específico. En la resistencia a Fenhexamid predominan al menos tres mutaciones en la posición crítica dentro del dominio transmembrana que es el blanco del fungicida (gen erg27) (412) en donde pueden ocurrir al menos tres cambios que generan altos niveles de resistencia: cambio de fenilalanina por serina (F412S), cambio de fenilalanina por isoleucina (F412I) o el cambio de fenilalanina por valina (F412V). En uva de mesa en Chile, hemos detectado que la serina y la isoleucina tienen alta agresividad y son las más difíciles de eliminar. La valina, por su parte, aparentemente provocaría un cambio estructural tan grande en el dominio transmembrana que posteriormente prácticamente desaparece. El cambio que experimenta no le permite ser viable.

Técnicas tradicionales: Niveles de sensibilidad a fungicidas mediante Crecimiento miceliar.

AVANZAR HACIA EL MONITOREO EN BASE A TÉCNICAS MOLECULARES

Explica la especialista que el monitoreo de sensibilidad es clave para diseñar adecuados programas de control, en base a las herramientas químicas más eficaces. El sistema tradicional de monitoreo de sensibilidad a fungicidas se realiza mediante pruebas de germinación conidial, de elongación de tubo germinativo o de crecimiento miceliar. En él, se preparan medios de cultivo diferenciales según fungicidas, luego se preparan suspensiones de conidias y se ajustan las suspensiones conidiales en el microscopio, para finalmente medir el desarrollo de los tubos germinativos luego de 16 horas de incubación, en el segundo caso se mantiene en incubación por más horas (24 horas) y en el tercer caso, el tiempo de incubación es mayor hasta que en la placa testigo sin fungicidas el micelio cubre toda la placa En general estos métodos requieren mucho espacio, muchos ojos y el tiempo de respuesta no permite tomar decisiones de control en un tiempo adecuado, en situaciones en que se puede estar aplicando productos de control químico cada cuatro días.

– ¿Qué técnicas de monitoreo se utilizan en la industria de las flores de Colombia?

– En la industria de las flores generalmente los monitoreos se hacen de forma tradicional, mediante técnicas bacteriológicas normales, a nivel de cultivos in vitro. Pero hay algunas empresas que ya están incorporando las técnicas moleculares en sus muestreos de presencia o ausencia de botrytis, pero desconozco si han incursionado en análisis de resistencia. La industria de las flores colombiana trabaja de manera muy seria y todos tratan de llegar con el menor índice de pudrición a destino, en general con sus propias capacidades analíticas. Inclusive muchas de las empresas tienen sus laboratorios en los cuales formulan productos biológicos. Seleccionan y producen sus propios trichodermas, por ejemplo, además de otros agentes biológicos, son muy eficientes en esta área.

– ¿Qué se debe tener en cuenta para monitorear sensibilidad de la población del hongo a fungicidas?

– Las técnicas tradicionales, que miden los niveles de sensibilidad a fungicidas mediante crecimiento miceliar, elongación del tubo germinativo y germinación conidial, son técnicas bacteriológicas que se demoran mucho. El resultado sale muy tarde, como tres a cuatro semanas después. En ese tiempo las flores ya se cortaron y se exportaron y están en la casa de los compradores finales. Por su parte, cuando se utiliza una técnica molecular, se analiza un mayor número de muestras por unidad y en menor tiempo, pero igual el análisis de alta resolución de fusión (HRM, por sus siglas en inglés) y reacción en cadena de la polimerasa en tiempo real (qPCR, por sus siglas en inglés), se demoran. Eso es lo que hacíamos antes. Se tomaba la muestra, hacíamos la recuperación de los aislados, obteníamos el cultivo puro monospórico y posteriormente extraíamos DNA y obteníamos la identificación de genotipos resistentes con los partidores específicos que diseñamos. Recientemente hemos iniciado un gran proyecto denominado “Saber ahora para aplicar mañana”. A partir de tejido vegetal, llámese flor o baya, vamos a extraer el DNA y solo 24 horas después le vamos a poder decir al productor el tipo de sensibilidad que tiene asociada y que tipo y frecuencia de mutación o mutaciones asociadas a resistencia a fenhexmid o a carboxamidas predominan en su población. En Chile esto va a ser un gran aporte para la Industria de la uva de exportación y de otros frutales, y potencialmente sería un gran aporte para la Industria de las flores de corte. El piloto lo estamos realizando en Chile.

– ¿Es una alternativa o tiene utilidad el monitoreo visual de la enfermedad?

– El monitoreo visual puede ayudar, pero lo que se hace -generalmente- es colocar las flores en bandejas sobre una rejilla, en condiciones de alta humedad y en oscuridad continua. Se tapan, ya sea introduciéndolas en una caja o en una bolsa plástica negra. Se dejan las muestras a oscuras para saber con qué nivel de inóculo iba la partida que se estaba cosechando. Es como un pronóstico de botrytis en flores, para determinar cuán efectivo fue el programa de control.

– ¿Existe el riesgo de confundir los síntomas de botrytis con el de otro patógeno?

– Los síntomas no los vas a confundir nunca, porque esporula rápidamente y en las flores se observan al principio las pequeñas manchas características de infección por botrytis. Pero hay algo que debemos tener claro, la botrytis no la vemos. No sabemos si ya está como conidia, si penetró o si está a punto de evidenciar el daño. Una vez que causa el daño recién vemos el síntoma, razón por la que es muy importante utilizar fungicidas que tengan efecto tanto sobre la germinación de la conidia, o sea, que revienten la conidia, que tengan un efecto sobre la elongación del tubo germinativo de esa conidia, o que tengan también un cierto efecto sobre el micelio que ha penetrado.

CONTROL EN BASE A QUÍMICOS, PERO TAMBIEN A ALTERNATIVOS

– ¿Puede dar algunos ejemplos de cómo actúan los principales ingredientes activo para control de botrytis?

– Por ejemplo, el grupo de las carboxamidas (ejs.: i.a. diclocymet, boscalid, fluopyram adepidyn) inhiben la germinación de la conidia y también la elongación del tubo germinativo; los phenylpyrroles (ej. Fludioxonil) revientan las conidias; el Fenhexamid y el Fenpyrazamine, que son hydroxyanilidas y amino-pyrazolinonas, respectivamente, tienen un efecto sobre elongación del tubo germinativo (ver diagrama Posicionamiento de Moléculas fungicidas); y sobre el inicio del crecimiento miceliar. Las anilinopyrimidinas, por ejemplo, cyprodinil y pyrimetanil, y mepanipyrim inhiben el inicio del crecimiento micelial aún cuando éste ya ha penetrado. Por eso es que la combinación Cyprodinil+Fludioxonil sigue siendo una mezcla eficaz cuando se utiliza de forma adecuada y en la dosis adecuada. Si la realidad es que vas a tener conidia en distintos estados, aplicar Fenpyrazamine de principio a fin, por ejemplo, no te sirve porque no tiene ningún efecto sobre las conidias, entonces tienes que ir intercalando moléculas de distintos modos de acción. En un buen programa se suele aplicar cada cuatro a cinco días, dadas las condiciones que tienen en Colombia. Pero lo ideal sería ir intercalando moléculas químicas, de alta eficiencia, con extractos de plantas y antagonistas biológicos, así como también la aplicación de productos activadores de mecanismos de defensa (SAR). Sin embargo, cuidado los antagonistas en las condiciones de Colombia, porque muchos así mismo son afectados por los fungicidas, por lo que me parecen más interesantes los extractos de plantas. La excepción sería Bacillus subtilus. Ya que, por ejemplo, prochloraz mata también los trichodermas.

Posicionamiento de Moléculas fungicidas de alta eficiencia en el Programa de Control.

– Bajo un programa de aplicaciones cada cuatro días, ¿utilizarías, por ejemplo, el día uno un químico, el día cuatro un biológico, el día ocho un químico y así en adelante?

– Claro, pero va a depender de la residualidad que presenten los productos. Para poner un ejemplo, las carboxamidas son productos que tienen una alta residualidad. Fácilmente, si no tienes mucha contaminación, podrías aplicarlo cada 7 días. Sin embargo, aun así se tendrías que realizar, previo a la cosecha, aplicaciones para proteger las varas que vas cortando.

– ¿No se aplican los productos según el estado fenológico del cultivo, sino a toda la nave?

– Por supuesto. Porque siempre vas a tener flores, no puedes decir este es el periodo crítico porque la flor es el periodo crítico. En los frutales el período crítico de control de botrytis corresponde a la flor. Botrytis afecta a las flores en todas las etapas de su desarrollo, desde antes de que abran hasta cosecha y durante la poscosecha, en la guarda y en transporte a destino.

– ¿Qué moléculas alternativas no residuales recomienda para el control de la enfermedad?

– Es importante enfatizar que las moléculas alternativas -no residuales- son un complemento para el control químico, pero que no reemplazan a las moléculas fungicidas de alta eficiencia. En el mercado, entre otros, se encuentran extractos de cítricos, como el de toronja (por ejemplo (BC-1000)), el extracto de Melaleuca alternifolia (árbol del té), el de Quillaja saponaria y el de Swinglea glutinosa. Tienen un efecto bastante interesante porque afectan la permeabilidad de la membrana, la respiración del hongo. Lo mismo el extracto de Melaleuca alternifolia, tiene un efecto preventivo y curativo. Sobre todo porque activan el mecanismo de defensa en las plantas. En antagonistas biológicos tenemos productos en base a Bacillus spp., a Trichodermas spp., Trichodermas + Bacillus. Estos compiten con botrytis por nichos y nutrientes y en algunos casos son estimuladores biológicos de las plantas e inductores de defensa de las plantas. Los trichodermas son efectivos, pero dependerá de la época. Así mismo Bacillus subtilis, siempre y cuando se use en dosis altas. Bacillus amyloliquefaciens es otro antagonista que recién se va a lanzar al mercado, todavía no está registrado. Estas son herramientas que van a permitir manejar la resistencia, pero nada más. Porque la resistencia va a ser el principal problema que van a tener los productores si no hacen programas adecuados. Se deben utilizar dentro del programa de control  moléculas de distintos modos de acción, la idea es evitar o disminuir al máximo el riesgo de que se desarrolle resistencia.

Situación en flores de corte: El mayor problema en flores de corte, como las rosas, es que los distintos estadios vegetativos se presentan al mismo tiempo. Lo ideal es intercalar moléculas de alta eficiencia con extractos de plantas y antagonistas biológicos, así como también con productos activadores de mecanismos de defensa (SAR).