Figura 1. Huerto de Avellano europeo (Corylus avellana) en el sur de Chile.

Corylus avellana, popularmente conocido como avellano europeo, es un cultivo que aumenta cada día su extensión en los campos chilenos, principalmente en las regiones del sur, cuyas características climáticas contribuyen a un desarrollo adecuado para este cultivo. Esta especie fue introducida en Chile por inmigrantes europeos en el siglo XIX, sin embargo, su mayor esplendor está ocurriendo en la actualidad, alcanzando más 20.000 ha plantadas en todo Chile (Figura 1). Esto está estrechamente correlacionado a un alza en la demanda de este fruto en el mercado internacional, por sus versátiles características, además por la diferencia estacional que ofrece Chile para mantener una producción continua a los países con alta demanda.

La avellana posee excelentes propiedades organolépticas, que la hacen un fruto muy popular en la industria alimentaria para la elaboración de helados, dulces y chocolates. Junto con esto, su composición rica en ácido grasos insaturados permite usarla como materia prima en la industria cosmética para la fabricación de aceites y cremas. Por otra parte, estudios recientes confirman que este fruto seco posee componentes bioactivos que combaten la atrofia cerebral en pacientes de Alzheimer. Y por si fuera poco, la cáscara residual de su procesamiento puede ser usada para la producción de biocombustibles. Todos estos elementos han condicionado que la avellana sea muy cotizada a nivel mundial, escenario donde se proyecta que Chile se posicione como uno de los mayores productores en los próximos años.

Sin embargo, junto con la expansión acelerada del avellano en el territorio nacional han aparecido enfermedades que inciden negativamente en su óptimo desarrollo. Entre ellas, la de mayor repercusión, es el tizón del avellano.

EL TIZÓN DEL AVELLANO ES UNA ENFERMEDAD BACTERIANA

El Tizón del avellano es una enfermedad bacteriana causada por el agente patógeno Xanthomonas arboricola pv corylina (Xac). Xanthomonas, es un género bacteriano muy extendido en los cinco continentes, representado por numerosas especies que son agentes causales de enfermedades que afectan a una amplia gama de cultivos de gran importancia agrícola. Sin embargo, una de las especies más dominante es Xanthomonas arboricola, antes denominada como Xanthomonas campestris y para la cual se han descrito 7 pathovares diferentes: pruni, corylina, juglandis, populi, poinsecttiicola, celebensis, fragariae; siendo los tres primeros los más agresivos.

Las Xanthomonas son células pequeñas (aprox. 1,5 µm de largo y 0,7 µm diámetro), en forma de bastones rectos, no forman esporas y tienen un solo flagelo polar que les permite moverse (Figura 2). Son Gram-negativas, positivos en la reacción de sulfuro de hidrógeno y de la actividad catalasa, oxidasa negativas, y no producen nitrato o indol. Este patógeno se asocia sólo con las plantas, colonizando y causando síntomas en todas las partes aéreas (tallos, ramas, hojas, flores, frutas y cogollos). En primera instancia actúan como epífitas por adhesión, o sea que se establecen en la superficie de los tejidos vegetales. Luego forman biopelículas (aglomeraciones celulares embebidas en exopolisacáridos) que les permiten sobrevivir ante condiciones adversas y posteriormente colonizan los tejidos vegetales penetrando a través de aberturas superficiales naturales como son estomas e hidátodos y/o también, por heridas (Figura 3). Una vez dentro de la planta estas bacterias producen Xantan, un polisacárido extracelular (EPS) que puede obstruir los vasos vegetales, produciendo necrosis tisular y marchitamiento severo de hojas. Los síntomas pueden manifestarse por manchas, cancros, hipertrofia, hiperplasia o incluso causar la muerte.

ACCIONES PARA SU ADECUADO CONTROL

El brote de la enfermedad (alta incidencia de ésta) se reportó por primera vez en Chile en el año 1987, sin embargo, aún persiste y ocasiona pérdidas de alrededor 30% de la cosecha. En aras de controlar la epidemia se aplican compuestos antimicrobianos basados en sulfatos de cobre a los cultivos de avellanas. Pero estudios recientes han demostrado que el uso intensivo de estos productos químicos causa resistencia microbiana y tienen un impacto ambiental negativo. Esta afectación se manifiesta en fitotoxicidad, contaminación de las aguas subterráneas y el suelo, afectando a la biota y la salud humana.

Esta situación lleva a un desafío inminente de crear un control de la enfermedad de avellana, más eficiente y amigable con el medio ambiente. Actualmente en el Laboratorio de Investigación en Biocontrol, perteneciente al BIOREN de la Universidad de la Frontera (UFRO), se realizan investigaciones para desarrollar una de las alternativas más prometedoras a corto plazo, el control biológico o biocontrol. Como parte de la investigación y para obtener un resultado más completo y eficiente, se está trabajando también en un sistema de detección temprana de esta enfermedad. El propósito propuesto es diagnosticar la presencia del agente patógeno antes de que este enferme la planta y ejercer el biocontrol en estadíos previos a la infección, para así evitar la propagación de la bacteria.

PCR CUANTITATIVA, HERRAMIENTA DE DETECCIÓN Y CUANTIFICACIÓN

Aunque las tecnologías de detección e identificación están disponibles para varios patógenos de plantas, la cuantificación de patógenos sigue siendo uno de los principales desafíos en el manejo de enfermedades para muchos cultivos. Actualmente, la reacción en cadena de la polimerasa en tiempo real (qPCR), es la técnica más sencilla para cuantificar un patógeno y es precisamente esta la técnica que queremos emplear para el agente patógeno del avellano. Por ello es que en el estudio que se está llevando a cabo, se desarrollan y validan un conjunto de partidores moleculares basados en la secuencia del gen 16S. Los partidores o cebadores (primer en inglés), son pequeños fragmentos (apróx. 18 a 20 pb) de secuencias de ADN que permiten a la enzima el reconocimiento de la secuencia que se requiere polimerizar, para aumentar su cantidad. En este caso los primers diseñados son específicos para la Xanthomonas, por tanto de un pull de ADN extraído de una muestra, será amplificado mediante qPCR solo aquel correspondiente a nuestro patógeno. Lo cual, permitirá la detección temprana y la cuantificación de Xac.

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De los partidores obtenidos inicialmente que amplificaban el gen 16S, se seleccionaron 5 pares basado en parámetros de calidad y coincidencia. Estos fueron validados in silico, e in vivo mediante PCR convencional y PCR en tiempo real. Los resultados mostraron una elevada eficiencia de cuantificación (98.99%) y un límite de detección de 0.04 pg µL-1. Todo lo cual demuestra que los cebadores diseñados tienen una alta sensibilidad para cuantificar biomasa de Xac en muestras biológicas complejas, como es el ADN de plantas infectadas. Por tanto, se visualiza que es viable la técnica para la detección temprana mediante el uso de PCR cuantitativa y además se podrá hacer una cuantificación del número de células del patógeno en la muestra procesada. Información que eventualmente, permitirá decidir si se requiere ejercer alguna actividad de control o no, e incluso la proporción en que se debe aplicar.

Con los métodos convencionales el diagnóstico tardaría alrededor de 3 semanas, porque implicaría el cultivo y purificación de la bacteria, extracción de ADN, secuenciamiento y análisis de la secuencias o por otra vía, mediante pruebas bioquímicas. Mientras que con el método que se está desarrollando bastaría con hacer la extracción de ADN de la muestra a analizar y realizar el qPCR, por tanto contando con los medios requeridos, en dos días -a más tardar- tendríamos listo el diagnóstico y además una aproximación del número de células presentes en la muestra. Lo cual no se puede estimar por los métodos convencionales.

PERSPECTIVAS DEL MÉTODO DE DIAGNÓSTICO

La Xanthomonas arboricola pv corylina, es un agente patógeno sumamente agresivo que ha causado cuantiosas pérdidas económicas al rendimiento del cultivo de la avellana en Chile y en todo el mundo; constituyendo una preocupación constante y generalizada en los productores de este fruto. Por tanto, es muy necesario ejercer un control eficiente para disminuir su impacto. El control que se realiza actualmente, basado en Sulfatos de Cobre no es efectivo e incide adversamente en el ambiente y es de riesgo para el hombre. En ese contexto y en el marco del proyecto Programa Tecnológico 16PTECFS-66647 de CORFO, el Laboratorio de Investigación en Biocontrol de la UFRO realiza investigaciones para obtener un biocontrol eficaz y amigable con el ambiente. En ese sentido fueron diseñados partidores específicos para la Xanthomonas, con el objetivo de poder hacer una detección temprana de este agente patógeno. Aunque faltan ensayos de laboratorio para corroborar rotundamente esta afirmación, hasta el punto donde se ha avanzado, este método molecular promete ser una herramienta robusta de detección por su elevada eficiencia y sensibilidad. Herramienta que facilitará tomar decisiones acertadas para el manejo de este cultivo y poder así combatir su mayor enfermedad, el Tizón del avellano europeo.

Agradecimientos

Programa Tecnológico “Centro para la investigación e innovación en fruticultura para la zona sur” (16PTECFS-66647) y a su proyecto “Sostenibilidad y uso eficiente de recursos en la producción de avellano europeo (Corylus avellana L.) en la zona centro sur de Chile”, ambos apoyados por Corfo.

Núcleo Científico y Tecnológico en Biorecursos (BIOREN).