Dr. Sebastián Molinett¹ y Dra. Danae Riquelme².

¹ Centro Regional de Investigación INIA La Cruz. ² Centro Regional de Investigación INIA La Platina.

La pudrición gris o pudrición del racimo, como se conoce a la enfermedad causada por Botrytis cinerea, es el problema de mayor relevancia fitosanitario en uva de mesa. Si bien es frecuente las pérdidas asociadas a esta enfermedad en campo y en embalaje, la incidencia aumenta sustancialmente cuando existen condiciones favorables de infección, como primaveras húmedas y precipitaciones desde pinta.

El control de esta enfermedad normalmente se realiza a través de manejos culturales, con fungicidas sintéticos convencionales en conjunto con el almacenamiento en frío e incorporación de generadores de anhídrido sulfuroso. Sin embargo, han surgido diversas alternativas de control que pueden ofrecer soluciones sostenibles, teniendo un origen natural (ya sean compuestos obtenidos de fuente de carbono biológico o sintético), y con un mayor grado de inocuidad para el consumidor que los fungicidas tradicionales que, a través de tecnologías de nanoencapsulación, pueden lograr un efecto fungicida para el control de patógenos.

El presente artículo discute acerca de la potencial contribución de estas tecnologías al desarrollo de soluciones fitosanitarias, particularmente en el caso de la pudrición gris en uva de mesa, identificando las oportunidades y desafíos para la implementación de esta clase de tecnologías en la uva de mesa.

EL PROBLEMA: LA PUDRICIÓN GRIS

En la actualidad, son más de tres especies de Botrytis las que han sido identificadas produciendo pudrición en uva a nivel mundial; sin embargo, la frecuencia de aislamiento indica que B. cinerea es la principal especie asociada, por lo que el control debe dirigirse en esa dirección.

La pudrición gris, causada por B. cinerea, se caracteriza por comenzar como un pardeamiento violáceo en la zona de infección de la baya, dejando la piel suelta y pulpa intacta. Este síntoma avanza sobre la baya observándose rápidamente crecimiento micelial grisáceo y esporulación del hongo. Otros síntomas frecuentes son las manchas marrones forma de ‘V’ de las hojas, junto con necrosis de brotes, y lesiones pardas en el raquis de los racimos. Estos forman parte de las fuentes de inóculo del hongo, en donde se multiplicará y diseminará a través de corrientes de aire.

Esta enfermedad se puede desarrollar en precosecha, asociándose a racimos apretados que generan un microclima de alta humedad relativa cercano a la baya. B. cinerea no requiere de heridas para infectar, aunque las heridas facilitan su entrada. Un ejemplo de ello fue la alta incidencia por pudrición de racimo asociada a partidura de bayas, que se observó en la zona central del país luego de la lluvia de fines de enero de este año. Principalmente se observaron microfisuras y partiduras, ubicadas principalmente en la zona distal y lateral de la baya, lo que generó una entrada directa del patógeno a la fruta. Esto coincidió con época cercana a cosecha de variedades como Thompson Seedless, observándose rápidamente una pudrición y esporulación del hongo, con la formación de nidos de Botrytis (Figura 1). El nivel de incidencia de la partidura estuvo asociado al estado de madurez y variedad de la fruta, dado por la cantidad de azúcar contenida que genera un diferencial de concentración que favorece el ingreso de agua a la baya.

Como es conocido, el control de esta enfermedad se basa la integración de manejos culturales que aumentan la ventilación cerca del racimo, como la regulación de la carga, raleo y arreglo de racimo, deshoje, desbrote y apertura de ventanas. La aplicación de estas prácticas es intransable, y en ellas se debe apoyar todo manejo. Sin embargo, la aplicación de productos químicos botryticidas es recomendada para la disminución de la densidad de inóculo los cuales pueden ser complementados con plaguicidas microbianos y extractos vegetales.

Debido a la capacidad de Botrytis de crecer e infectar desde 0 °C, infecciones latentes no desarrolladas en precosecha a menudo se activan durante el almacenamiento en frío, cuando las condiciones de la uva son favorables su desarrollo. Los fungicidas no son del todo efectivos en el control de infecciones latentes, por lo que la aplicación con anhídrido sulfuroso, como gasificación y mediante generadores es considerada como una medida eficaz para la inactivación de estas y nuevas infecciones.

EL DESAFÍO DE INCORPORAR SOLUCIONES INOCUAS

La alta incidencia de pudrición observada este año planteó el desafío de incorporar soluciones inocuas, de efecto inmediato y de liberación controlada, de baja o nula carencia para el control de esta enfermedad. Además, dada las restricciones de los mercados de destino, existe un número limitado de aplicaciones e ingredientes activos que se pueden utilizar. Por lo tanto, se observa una brecha en las tecnologías disponibles para el control de la pudrición gris en vid, extrapolable a otros cultivos.

En postcosecha, la fumigación con anhídrido sulfuroso (SO₂) y el uso de generadores de este compuesto, es una práctica frecuente y se aplica de forma exitosa para el control de la pudrición gris. Sin embargo, presenta ciertas desventajas por sus efectos residuales sobre la baya a nivel organoléptico (alteración del sabor) y de aspecto (lesiones por blanqueamiento) cuando se utiliza en forma inadecuada. Por ello, es necesario el desarrollo de alternativas a este compuesto, idealmente de liberación gaseosa controlada durante el tiempo de almacenamiento y con una visión más inocua para el tratamiento de los racimos.

ALTERNATIVAS AL ANHÍDRIDO SULFUROSO

Como métodos alternativos de control, en la literatura se ha reportado que la fumigación con ácido acético ha logrado disminuir el deterioro de las bayas por Botrytis y Penicillium de forma significativa y que podría constituir una alternativa al tratamiento con SO₂; sin embargo también presenta ciertos problemas relacionados con su impacto organoléptico en la baya. Por otra parte, la aplicación de dosis sub-letales de etanol, en formato de soluciones hidroalcohólicas combinada con sales de potasio, podrían ser efectivas en controlar la pudrición gris. También, se ha estudiado el uso de (E)-2-hexenal, compuesto con propiedades antifúngicas producido significativamente de forma natural por el tejido vegetal, disminuye el deterioro por Botrytis en diversos modelos de fruta, incluyendo uva de mesa. Además, la aplicación en postcosecha de jasmonato -una hormona que participa de la respuesta de defensa de las plantas contra el ataque de fitopatógenos- ha mostrado buenos resultados en el control de la pudrición gris. Otros compuestos que han sido evaluados con resultados prometedores para el control de enfermedades fúngicas en uva de mesa son gases como el ozono, biopolímeros como el quitosano, sales de carbonato y bicarbonato, entre otros productos antimicrobianos.

Otro tipo de productos alternativos son los extractos de plantas y aceites esenciales. El extracto de Aloe vera, una planta tropical y subtropical usada por siglos por sus propiedades medicinales y terapéuticas, ha sido probado con éxito para su uso como recubrimiento antimicrobiano para preservar la calidad en la post-cosecha de diversas frutas y vegetales, incluyendo uva de mesa, e inhibiendo la proliferación de esporas de B. cinerea. Además, extractos de Satureja hortensis (Ajedrea de jardín) han mostrado ser efectivos contra Alternaria mali y B. cinerea. También, extractos de semillas de Xylopia aethiopica (pimienta etíope) y Zingiber officinale (jengibre) fueron efectivos contras Aspergillus niger y A. flavus. Por otra parte, el interés en los aceites esenciales y su aplicación en conservación de alimentos ha aumentado durante los últimos años debido al incremento de la percepción negativa de los preservantes sintéticos por parte de los consumidores.

Los aceites esenciales de canela y clavo han mostrado resultados exitosos para el control en uva de enfermedades causadas por diversos hongos tales como Aspergillus, Alternaria, Colletotrichum, Lasiodiplodia, Botrytis, entre otros. Además, aceites esenciales de orégano y romero por sí solos y en combinación fueron capaces de inhibir el crecimiento de los hongos tales como Aspergillus y Botrytis. También, componentes activos de diversos aceites esenciales, tales como eugenol, carvacrol, timol, entre otros han mostrado ser efectivos en el control de la pudrición gris, causada por B. Cinerea.

Un aspecto técnico a resolver por estos productos tiene relación con que sus mecanismos de liberación a la fruta permitan que estos sigan entregando estos compuestos por todo el período de exportación. Finalmente, otra limitación importante que enfrentan estas alternativas es el que su aplicación sobre la fruta no altere sus propiedades organolépticas al momento del consumo. Además, algunos de estos productos mencionados deben resolver limitaciones acerca su escalabilidad a nivel industrial y comercial que permitan conseguir un producto final con precios competitivos a alternativas que están disponibles comercialmente, como es el caso de SO₂.

En los últimos años ha surgido una nueva clase de alternativas basada en compuestos naturales formulados mediante el uso de herramientas de la nanotecnología, como fruto del trabajo de investigación y desarrollo en esta temática a nivel mundial. En ese contexto, tales herramientas pretenden ofrecer alternativas efectivas (con baja o nula carencia para controlar la enfermedad), junto con resolver la limitantes planteadas mediante de las capacidades de ser inocuas, tener buena fijación, estabilidad, liberación controlada; además de poseer bajo o nulo impacto organoléptico sobre la fruta.

¿QUÉ ES LA NANOTECNOLOGÍA?

La nanotecnología es una disciplina científico-tecnológica que es capaz de generar mediante diversas técnicas una gran variedad de materiales con tamaños de partículas en el rango de 1 a 100 nm, con múltiples aplicaciones en las distintas áreas de nuestra sociedad debido a las diversas propiedades que se pueden lograr con un material formulado a nanoescala.

Cabe señalar que entre las diferentes aplicaciones se encuentran los compuestos antibacterianas y antifúngicas empleados sobre productos hortofrutícolas y alimentos frescos en general. Estas tecnologías presentan una mayor efectividad debido a una mayor superficie reactiva por unidad de volumen, respecto a los materiales bioactivos originales, reduciendo las dosis requeridas. Además, mejoran la fijación, estabilidad y liberación de las dosis de bioactivos utilizadas para un determinado fin, disminuyendo la probabilidad de contaminación del medio ambiente.

POTENCIALES SOLUCIONES NANOTECNOLÓGICAS PARA EL MANEJO DE ENFERMEDADES DE UVA DE MESA

En los últimos años se ha avanzado en el estudio de la incorporación de agentes antimicrobianos naturales en recubrimientos comestibles, para controlar la difusión y liberación de compuestos activos y mantener sus concentraciones a un nivel adecuado en la superficie de frutas y hortalizas durante su proceso de almacenamiento-envío hacia los mercados de destino.

Recientemente, los sistemas de administración de nanoencapsulados y nanolaminados-multicapa han surgido como herramientas prometedoras para mejorar la funcionalidad de los recubrimientos comestibles aplicados en el control de la contaminación microbiana de productos hortofrutícolas. El uso de nanoestructuras que poseen propiedades antimicrobianas podría mejorar la inocuidad y la calidad de frutas y hortalizas mediante el control de la contaminación y el crecimiento de patógenos (bacterias y hongos), además de la eliminación de poblaciones de microorganismos en los productos hortofrutícolas. Una de las principales ventajas de utilizar nanoestructuras por sobre micro o macroestructuras es su capacidad para cubrir una mayor área de superficie, lo que aumenta la eficiencia antimicrobiana de los productos nanocompuestos. El desarrollo de nanoemulsiones ‘in situ’ a partir de formulaciones para recubrimientos comestibles a base de aceites esenciales, emulsificantes y biopolímeros, se ha investigado como una estrategia eficaz para inmovilizar agentes antimicrobianos en la superficie de frutas y hortalizas frescas y mínimamente procesadas.

Entre los sistemas de nanoencapsulación, que se utilizan actualmente como sistemas de administración de antimicrobianos naturales para aplicación en productos hortofrutícolas, las nanoemulsiones han recibido especial atención porque pueden formularse con ingredientes naturales de grado alimenticio y su proceso de producción es factible de escalar en la industria mediante procesos de homogeneización a alta presión. Las nanoemulsiones se definen como sistemas heterogéneos dentro de un tamaño nanométrico (inferior a los 100 nm) compuestos por 2 líquidos inmiscibles (aceite y agua) que se mezclan para formar una fase homogénea y/o estable mediante el uso de un emulsificante apropiado.

En particular, las nanoemulsiones de aceite en agua, que han atraído la atención generalizada como sistemas de liberación controlada (para frutas, hortalizas y toda clase de alimentos), consisten en gotitas nanométricas de aceite dispersas en una fase continua acuosa, donde cada nanogota está rodeada por una fina capa de interfase consistente en un emulsificante de grado alimenticio y/o biopolímero (Figura 2; Adaptado de Aloui y Khwaldia, 2016). Se ha demostrado que este tipo de desarrollos tienen gran efectividad para inhibir un amplio espectro de bacterias y hongos; sin embargo, a la fecha se han reportado pocos desarrollos de esta clase para su aplicación en uva de mesa. Particularmente, se ha mostrado del desarrollo de nanoemulsiones basadas en aceite esencial de citronela (lemongrass) formulada con cera de carnauba y usando Tween-80 como emulsificante, la cual mostró ser efectiva para inhibir en uva la proliferación de bacterias como Salmonella typhimurium y Escherichia coli. Por este motivo, es necesario avanzar en el desarrollo de nuevas nanoemulsiones capaces de controlar la pudrición gris, y específicamente de inhibir su agente fúngico causal Botrytis cinerea.

TRABAJO EN PROGRESO Y PROYECCIONES

Con la finalidad de contribuir con el desarrollo de soluciones nanotecnológicas para el control de la pudrición gris en uva, el laboratorio de Bionanotecnología para la hortofruticultura de INIA la Cruz, junto con el laboratorio de Fitopatología de INIA La Platina, han estado trabajando en tres nanocompuestos, formulados como nanoemulsiones basadas en diversos aceites esenciales, emulsificantes y biopolímeros; todos ellos de origen natural y de grado alimenticio. Los primeros testeos de los prototipos indican que es posible una reducción estadísticamente significativa del crecimiento micelilal del hongo B. cinerea tanto por contacto como por acción de metabolitos volátiles, con resultados auspiciosos en especial del nanocompuesto C (Figura 3), aunque a futuro podrían ser mejorables en cuanto a sus efectividades. Además, el efecto de los compuestos sobre B. cinerea fue corroborado en una prueba in vivosobre bayas, donde el compuesto C inhibió en un 61% la colonización por el hongo, siendo una formulación promisoria para el control inocuo y sustentable de la enfermedad causada por este hongo.

En vista de los resultados obtenidos, se continuará con este trabajo interdisciplinario para incrementar la efectividad antifúngica de los nanocompósitos contra estos patógenos. Ello se llevará a cabo a través de nuevas rondas de iteración en las formulaciones de sus componentes bioactivos, para mejorar principalmente la superficie de contacto de las partículas y su cinética de liberación controlada de los compuestos antifúngicos formulados. Además, se espera realizar nuevas pruebas de efectividad de los nuevos compuestos contra los patógenos estudiados, tanto in vitro como in vivo en fruta desafiada con sus inóculos. También, se desarrollarán pruebas en condiciones piloto, replicando las condiciones de almacenamiento y trasporte de la uva de mesa de exportación. De esta manera, el equipo de INIA espera continuar contribuyendo en la búsqueda de nuevas alternativas y estrategias de control para estos importantes problemas que afectan seriamente a la industria de la uva de mesa.

AGRADECIMIENTOS

Proyecto Subsecretaría de Agricultura 503002: “Apoyo para la iniciación en la investigación en Biotecnología agroalimentaria”.

REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS

Aloui, H., & Khwaldia, K. 2016. Natural Antimicrobial Edible Coatings for Microbial Safety and Food Quality Enhancement. Comprehensive Reviews in Food Science and Food Safety, 15 (6): 1080-1103. https://doi.org/10.1111/1541-4337.12226

IQonsulting. 2020. Anuario del mercado de uva de mesa 2018-2019.

Ramos, O. L., Pereira, R. N., Cerqueira, M. A., Martins, J. R., Teixeira, J. A., Malcata, F.X., António A. Vicente, A.A. 2018. Chapter 8 – Bio-Based Nanocomposites for Food Packaging and Their Effect in Food Quality and Safety. In Handbook of Food Bioengineering, Food Packaging and Preservation, Academic Press, P271-306, ISBN 9780128115169. https://doi.org/10.1016/B978-0-12-811516-9.00008-7.

Sonker, N., Pandey, A. K., & Singh, P. 2016. Strategies to control post-harvest diseases of table grape: a review. Journal of Wine Research. DOI: 10.1080/09571264.2016. 1151407.